Kutatás
Mechanoelektromos jelátvitel a szrsejtekben
Elektromechanikus jelátvitel a küls szrsejtekben
Mechanoelektromos jelátvitel a szrsejtekben
A cochlearis folyadékterek hangingerek által kiváltott vibrációját a sztereociliumokban elhelyezked mechanoszenzitív ioncsatornák alakítják át elektromos árammá. Ezen csatornák kapuzását (azaz nyitását és záródását) a sztereociliumok dlése szabályozza. A kapuzás pontos részletei a mai napig nem ismertek, bár valószínleg egy tisztán mechanikai jelenségrl van szó, amit a folyamat elképeszten nagy sebessége valószínsít (denevérekben 200 kHz, emberben csupán 20 kHz). Ismert, hogy a kapuzó mechanizmus összefüggésben van egy különösen vékony, kb. 6 nm átmérj, az egyes szeteociliumokat összeköt, extracelluláris filamenttel, az úgynevezett tip link-kel. A tip link károsodása (pl. túlzottan nagy intenzitású hangingerek alkalmazása során bekövetkez kórosan erteljes stimulációt követen) süketséget okoz.
Munkacsoportunk a mechanoelektromos jelátvitelt vizsgálja, amelynek során a patch-clamp technika teljes sejtes-konfigurációjával történ ionárammérést, valamint ezzel párhuzamosan a ketts-foton konfokális mikroszkópiával történ intracelluláris kalciumkoncentráció-meghatározást végzünk. Megmutattuk, hogy a tip link-ek enzimatikus vagy nem enzimatikus módon történ roncsolása után a csatornák nyitott állapotba kerülnek, ami egy "tónusos" áram kialakulását eredményezi (Meyer és mtsai., 1998). Nemrégiben azt is bizonyítottuk, hogy ez a tónusos áram mechanoszenzitív és a kapuzó mechanizmusa kalciumfüggést mutat (Meyer és mtsai., 2005). Ezek az eredmények egy intracellulárisan elhelyezked és kalciumfüggést mutató elasztikus kapuzó mechanizmus jelenlétét bizonyítják.
Elektromechanikus jelátvitel a küls szrsejtekben
A küls szrsejt (outer hair cell - OHC) membránpotenciáljának változása mechanikai ervé alakul, ami a sejttest összehúzódását és megnyúlását okozza. Számos kutató szerint ez az elektromosság által kiváltott mozgás (ún. elektromotilitás) az alapja a cochlea különleges frekvenciaszelektivitásáért, érzékenységéért és széles dinamikai tartományáért. Úgy gondolják, hogy a sejtek által kiváltott elektromechanikus er ellensúlyozza a cochleában fellép, a folyadék és a sejtek mozgásából származó csillapítást, és ezáltal biztosítja a cochlea egyedülálló mechanikai hangoltságát. A szomatikus elektromotilitásért felels motor molekulát Peter Dallos munkacsoportja klónozta. Ez, a prestinnek elnevezett molekula az iontranszporter 26 géncsaládba tartozik, amely család aniontranszportereket és ezekkel rokon fehérjéket kódol. Legalább 6000 ilyen molekula található a szrsejtek felszíni membránjának minden mm2-én. Az még a mai napig nem ismert, hogy ezen molekulák mozgása hogyan kapcsolódik a citoszkeletonhoz és hogyan jön létre a szomatikus elektromotilitás. Hasonlóan a sztereociliumokban zajló eletromechanikus transzdukcióhoz, ennek a mechanizmusnak is elképeszten gyorsnak kell lennie, hiszen az ultraszonikus frekvenciatartományban is megfelelen kell mködnie. Az elbbiekben vázolt transzdukciós mechanizmus károsodása süketséget okoz.
Munkacsoportunk az elektromechanikai transzdukció mechanizmusát tanulmányozza lézer Doppler-vibrométer és az atomer spektroszkópia együttes alkalmazásával. A vibrométer alkalmazásával kimutattuk, hogy a szomatikus elektromotilitás a membránpotenciál változását ciklusról-ciklusra, legalább 100 kHz-ig követni képes (Frank és mtsai., 1999). Ezen eredmény alapján megállapítottuk, hogy a küls szrsejt sejttestje rendelkezik azon molekuláris gépezettel, ami csupán kismérték csillapítással és késleltetéssel képes jóval a hallásküszöb fels határát meghaladó frekveciájú elektromechanikus válasz kialakítására. Azóta kifejlesztettünk egy olyan új eljárást, amellyel biológiai struktúrák mechanikai tulajdonságai tanulmányozhatók akár 40 kHz-ig (Scherer és mtsai., 2000; Scherer és Gummer, 2004a).
A módszer egy atomer mikroszkópiás miniatr tt ("cantilever") alkalmaz, és a hallásbiológiai kutatásokon kívül is használható. A módszer különösen elnyös oldatban elhelyezked biológiai minták tanulmányozására. Ezen módszer felhasználásával a cochleában lév sejtek és membránstruktúrák biológiai és mechanikai tulajdonságait vizsgáljuk.
A cochlea nagy érzékenysége, frekvenciaszelektivitása és széles dinamikai tartományt átfogó képessége csupán mechanikai ersítés segítségével valósítható meg. Az ersít mechanizmussal kapcsolatosan két különböz nézet is létezik. Mindkét hipotézis azon alapszik, hogy az ert az elektromechanikus transzdukció állítja el a küls szrsejtben. Az egyik elképzelés szerint azonban a transzdukció a sejt szómájában történik, míg a másik szerint a sztereociliumokban. A szóma hipotézis másik elképzeléssel szembeni elnye az, hogy (amint az ismeretes) a küls szrsejt a teljes, funkcionálisan lényeges frekvenciatartományban képes az elektromotilitásra (Frank és mtsai., 1999). Ennek az elképzelésnek a hátránya ugyanakkor, hogy a receptorpotenciált (ami a szomatikus elektromotilitás hajtóereje) a basolaterális sejtmembrán impedanciája szri (low-pass filtering, Preyer és mtsai, 1996). Az említett mechanizmus azonban a receptorpotenciálnak a sztereociliumok elmozdulásához képesti olyan mérték csillapítását és késleltetését eredményezi, hogy a szomatikus elektromotilitás önmagában biztosan nem tehet felelssé a cochlearis ersítés mechanizmusáért. A második elképzelésnek vagyis annak, hogy a nagyfrekvenciás elektromechanikai transzdukció a sztereociliumokban játszódik le, megvan az az elnye, hogy ebben az esetben a sztereociliumok mebránja nem viselkedik alul átereszt szrként, ám hátrányára válik, hogy a mai napig nem létezik közvetlen bizonyíték arra vonatkozólag, hogy magas frekvenciákon a sztereociliumok elektromotilitással rendelkeznének. Megjegyzend ugyanakkor, hogy Robert Fettiplace munkacsoportjának van kísérletes bizonyítéka arra, hogy a küls szrsejtek sztereociliumai tartalmaznak elektromechanikus jelátalakítókat. A kérdés, azonban, hogy az itt létrejöv transzdukció megfelelen magas frekvenciákon is mködképes-e és vajon képes-e elegenden nagy ert a Corti-szervbe juttatni, továbbra is megválaszolandó.
Munkacsoportunk a küls szrsejtek cochlearis ersítésben betöltött szerepét vizsgálja. Három dimenziós vibrációs méréseket végezve arra az eredményre jutottunk, hogy a membrana tectoria sugár irányú rezonanciára képes (Gummer és mtsai., 1996; Hemmert és mtsai., 2000a). Véleményünk szerint a rezonanciamozgás idbeli tulajdonságai lehetséget adnak a küls szrsejt basolateralis membránjának elektromos impedanciája által kiváltott szomatikus elektromechanikai er okozta késleltetés kompenzációjára. Ezek a kísérletek adták az els ötletet arra vonatkozólag, hogy az elektromechanikai er milyen módon tevdhet át a Corti-szervre, hogy ezáltal létrehozza a cochlearis ersítést. Mivel magas frekvenciákon a Corti-szerv csillapítása és tehetetlensége szintén kiválthatja az elektromechanikai er jelentékeny csökkenését és késleltetését, meghatároztuk a Corti-szerv mechanikai impedanciáját is (Scherer és Gummer, 2004a). Azt találtuk, hogy pontszer terhelést követen a Corti-szerv tisztán viszkoelasztikus anyagként viselkedik, valamennyi fiziológiailag fontos ingerlési frekvencián, azaz a rendszerben nem található tehetetlenségi komponens. Összekapcsolva az impedanciaméréseket a Corti-szerv sebességének meghatározásával (a cochleán belüli elektromos stimulációt követen) megállapítottuk, hogy a lamina reticularisra kifejtett elektromechanikai ernek széles rezonanciamaximuma van (Scherer és Gummer, 2004b). Úgy gondoljuk, hogy a küls szrsejtek piezoelektromos rezonanciája, ahogyan azt Bill Brownell és munkatársai is felvetették, lehet a felels az er széles rezonanciamaximumáért. Elképzelhet, hogy ez a rezonancia kompenzálhatja a küls szrsejt basolaterális membránjának elektromos impedanciájából adódó amplitúdócsillapítást. Jelenleg azon dolgozunk, hogy meghatározzuk az elektromechanikai er és a sztereociliumok közötti kapcsolatot a bels szrsejtekben.
Bár számos audiológiai teszt létezik a halláskárosodások differenciáldiagnózisára, még mindig nincs lehetségünk arra, hogy meghatározzuk a humán cochleában esetlegesen jelenlév mechanikai hibák pontos helyét. Ez fként abból fakad, hogy az emberben a belsfül a halántékcsontba ágyazott, aminek következtében a közvetlen orvosi vizsgálatok szempontjából megközelíthetetlen. A cochlearis ersítésbl származó halláskárosodás egyetlen klinikai jele az otoakusztikus emisszió hiánya. Sajnos az emissziós jelek vizsgálata még nem teszi lehetvé a cochlearis ersítés differenciáldiagnózisát. Nincs lehetségünk például annak eldöntésére, hogy adott esetben mi tehet felelssé a cochlea hibás mködéséért. Nem tudjuk eldönteni, hogy a küls szrsejtek sztereociliumainak és az ket fed membrana tectoria elkülönülése okolható a hibáért vagy a küls szrsejtek basolateralis membránjában található motormolekulák szerkezében létrejöv változás lehet a hiba forrása vagy esetleg valami teljesen más.
Annak érdekében, hogy kifejleszthessünk a cochlearis ersítés differenciáldiagnosztikáját szolgáló technikát, egy lézerinterferometriás módszert hoztunk létre, ami lehetséget teremt a cochlea mechanikai bemeneti impedanciájának megmérésére. A módszer alkalmazása során a dobhártya rezgését követjük nyomon, és a berendezést "Lézeraudiométer"-nek neveztük el. A vizsgálat azon az elven nyugszik, hogy a cochlea bemeneti impedanciája a középfül impedancia terheléseként jelentkezik, vagyis a cochleában létrejöv mechanikai változások elméletileg nyomon követhetek a dobhártya rezgésének tanulmányozásával. A vizsgálatokat lehetvé teend, újraterveztük egy korábbi, a hallásküszöb körüli vibrációméréseket szolgáló készülékünket (Rodriguez Jorge és mtsai., 1997). Már sikerült bizonyítékot találnunk cochlearis eredet komponensre a dobhártya rezgéseinek vizsgálata során. Jelenlegi kísérleteinket szenzorineurális eredet halláskárosodásban szenved betegek felbecsülhetetlen érték segítségével végezzük.
A küls szrsejtek, ugyanúgy mint más polarizált sejtféleségek, rendelkeznek egy tubulosokból és vesiculumokból felépül endoplasmás reticulummal. Ez a struktúra számos specifikus funkciót szolgál, pl. fehérjeszintézis, kalciumtárolás, szteroidok szintézise és glikogénprodukció és tárolás. Úgy tnik, hogy a küls szrsejt az egyik legösszetettebb ilyen hálózattal rendelkez sejt. A laterális ciszternák, amik a küls szrsejtek endoplasmaticus reticulumának integráns részét képezik, szintén fontos szerepet játszanak a sejtben végbemen membrán le- és felépítésében. Ismert, hogy a szrsejtek mind az apicalis (endocitózis), mind a szinaptikus (exocitózis) pólusuknál egyaránt rendelkeznek endocitotikus aktivitással. Nem világos azonban a membrán recirkulációjának, és ezen belül is az endocitózisnak a sejt mködésében betöltött pontos szerepe.
Munkacsoportunk a membrán újraépülésének mechanizmusát vizsgálja. Az küls szrsejtek vesikulum-transzportját különböz fluorescens festékek, pl. FM 1-43 (egy membránmarker), DiOC6 (az endoplasmaticus reticulum markere) és neutral red (lizoszóma-marker) segítségével tanulmányozzuk. A fluorescens jelet ketts-foton konfokális mikroszkópia segítségével tanulmányozzuk. Az FM 1-43 festék reverzibilisen kötdik a membránhoz, az endocitózist követen a vesiculomokba zárt festék jól látható. Kimutattuk, hogy a küls szrsejtek apicalis felszínén endocitózis történik, és az intracelluláris térbe jutó membrándarabok az infrakutikuláris területre, a felszíni membrán alatt elhelyezked ciszternákba és a szinaptikus régióba vándorolnak (Meyer és mtsai. 2001). A jelenleg folyó kutatások célja a küls szrsejtekben folyó intracelluláris vesiculum-transzport szabályozómechanizmusainak feltérképezése.
A matematikai modellezés során a kísérletekbl származó információkat építjük be a cochlea hangfeldolgozását leíró modellekbe, annak érdekében, hogy jobban megérthessük annak mködését és új diagnosztikai eszközöket fejleszthessünk ki.
A Corti-szerv egy modelljét Charles Steele (University of Standford) segítségével közösen fejlesztjük. A modell alkalmazása a kísérletek során kapott (Scherer és Gummer, 2004a) mechanikai impedancia értékeknek megfelel adatokat eredményez. Másfell, a modell magyarázattal szolgál arra a kísérleti eredményre, miszerint az impedancia tisztán viszkoelasztikus és nem tartalmaz tehetetlenségi komponenst. Azon dolgozunk, hogy a modellt beépítsük a cochlea mködését leíró általános modellbe.
Diagnosztikai vizsgálatainkat Renato Nobili professzorral (University of Padua) együttmködve végezzük, amelynek során az otoakusztikus emisszió eredetét kutatjuk. Ezeket az akusztikus jeleket, amelyeket néha akusztikus stimuláció nélkül is rögzíthetünk (spontán emisszió), akusztikus stimulációval (akusztikusan kiváltott emisszió) vagy elektromos jellel (elektromosan kiváltott emisszió) is kiválthatunk, az egészséges cochlea produkálja. Ezek a jelek a küls szrsejtek elektromechanikus mködésének a melléktermékei. Az akusztikusan kiváltott otoakusztikus emisszió vizsgálata objektív jelzje a cochlearis ersítés megfelel mködésének, így ez az eljárás különös jelentséggel bír az újszülöttek vizsgálatában. Az emissziót kiváltó mechanizmusok még nem teljesen ismertek, így optimális stimulációs protokol még nem létezik. Jelenlegi munkánk a fenti problémákat kívánja megoldani.
A küls szrsejt receptoráramának mérése
Ketts-foton konfokális mikroszkóp
A küls szrsejt által
kifejtett er mérése
Mechanikai impedancia mérése
A Corti-szerv vibrációjának mérése
Lézeraudiometria
Küls szrsejt ketts
jelölése
A cochlea hidrodinamikai modelljének térbeli
ábrázolása